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Laboratórios de Desenvolvimento de
Bioprocessos da Escola de Química da UFRJ

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Produção Científica: Teses de Doutorado

Desenvolvimento de Processo para Produção de Xilanase termofílica utilizando Linhagem Selvagem e Sistemas de Expressão Heteróloga

Autora: Mônica Caramez Triches Damaso
Ano da Defesa: 2003
Orientadores: Nei Pereira Jr. PhD e Carolina Maria M. C. Andrade, Dr. rer. nat.
Programa: TPQB - Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos da EQ/UFRJ
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Resumo

Nos últimos anos, as xilanases têm sido utilizadas em vários setores industriais, tais como no alimentício, no têxtil e no de polpa e papel. Neste trabalho, a enzima xilanase foi produzida por Thermomyces lanuginosus IOC-4145 e por sistemas de expressão heteróloga. O fungo Thermomyces lanuginosus foi capaz de produzir 500 U/mL de uma xilanase livre de celulase em fermentação submersa e 850 U/mL em fermentação em estado sólido usando sabugo de milho como fonte de carbono.

A otimização da composição do meio de cultivo nas diferentes fermentações foi conduzida utilizando-se o planejamento experimental. Sabugo de milho e KH2PO4 foram apontadas como as variáveis mais importantes na produção enzimática em cultivo submerso e em estado sólido, respectivamente.

A influência de vários reagentes químicos na atividade xilanásica do extrato bruto foi investigada. Na presença de ditiotreitol e ß-mercaptoetanol na molaridade de 5mM a atividade enzimática foi aumentada em 40 e 53%, respectivamente, em relação ao controle.

O uso da xilanase nativa na hidrólise enzimática de sabugo de milho e bagaço de cana para produção de xilose, proporcionou a obtenção de graus de hidrólise de 24 e 52%, respectivamente, para estes resíduos da agroindústria.

A produção da enzima foi também efetuada por clonagem do gene da xilanase de T. lanuginosus em Pichia pastoris sob o controle do promotor AOX1. As colônias de P. pastoris expressando a xilanase recombinante foram selecionadas pela atividade enzimática em análise em placa e a habilidade das referidas colônias em secretar altos níveis da enzima foi avaliada em culturas em pequena escala (5 e 50 mL).

Além disso, uma otimização da produção enzimática foi conduzida utilizando o desenho fatorial 23. A influência da densidade celular inicial (DCI) e das concentrações de metanol e yeast nitrogen base foi avaliada e a DCI foi apontada como sendo a variável mais importante.

O perfil cinético da produção de xilanase recombinante em frascos cônicos de 1L nas condições otimizadas foi conduzido e 360 U/mL (148 mg/L) de xilanase foram obtidas.

As xilanases nativa e recombinante foram purificadas por gel filtração e seus pesos moleculares estimados por eletroforese em poliacrilamida como sendo 25,5 e 26,9 KDa, respectivamente.

Os perfis de temperatura ótima e de termoestabilidade, bem como o espectro de dicroísmo circular das xilanases recombinante e nativa foram idênticos. Para ambas as enzimas, a temperatura ótima foi de 75°C, retendo 60% das suas atividades iniciais após 80 minutos a 70°C ou 40 minutos a 80°C.

Finalizando, a produção da xilanase recombinante em biorreator usando alimentação contínua de metanol mostrou ter atingido os melhores resultados de atividade xilanásica (440 U/mL), produtividade volumétrica (7730 U/L.h) e de taxa específica de crescimento (0,11 h-1), sendo atrativa para aplicações industriais.

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