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LADEBIO

Laboratórios de Desenvolvimento de
Bioprocessos da Escola de Química da UFRJ

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Produção Científica: Teses de Doutorado

Produção de asparaginase por Saccharomyces cerevisiae e por expressão heteróloga do gene ASP3 em Pichia pastoris

Autora: Maria Antonieta Ferrara
Ano da Defesa: 2004
Orientadores: Nei Pereira Jr., PhD e Elba Pinto da Silva Bon, PhD
Programa: TPQB - Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos da EQ/UFRJ
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Resumo

A asparaginase é uma enzima utilizada no tratamento de leucemia linfoblástica aguda. O medicamento, obtido a partir dos procariotos Escherichia coli e Erwinia crysanthemi, apresenta severas reações imunológicas, em que pese a sua eficiência. A enzima existente no mercado brasileiro é importada, o que dificulta o seu uso por questões de preço e abastecimento. A asparaginase pode também ser obtida a partir do eucarioto Saccharomyces cerevisiae, podendo ser esta uma alternativa às enzimas bacterianas. No presente trabalho, foi estudada a produção da asparaginase II, codificada pelo gene ASP3 de S. cerevisiae.

Em uma primeira etapa, foi utilizada uma linhagem mutante de S. cerevisiae ure2dal80 parcialmente desreprimida para nitrogênio. Avaliou-se o efeito do pH do meio de cultura (meios tamponados e não tamponados na faixa de pH 4,5 - 6,5) e da fonte de nitrogênio (prolina, uréia ou sulfato de amônio) no bioprocesso de produção de asparaginase.

Observou-se que as condições estudadas não afetaram significativamente o crescimento celular e o consumo de glicose. A produção da enzima, contudo, foi afetada tanto pelo pH do meio de cultura quanto pela qualidade da fonte de nitrogênio: o uso de tampão protegeu a enzima periplásmica de inativação e as fontes de nitrogênio não repressoras uréia e prolina permitiram a obtenção de níveis de enzima 1,5 vezes superiores com relação à fonte repressora amônio. Os rendimentos máximos de produção da enzima foram de 115 U/g de massa celular.

Em uma segunda etapa, o gene ASP3 foi clonado e expresso na levedura metilotrófica Pichia pastoris. A linhagem recombinante de P. pastoris produziu a enzima asparaginase em níveis sete vezes superiores em relação àqueles observados para S. cerevisiae, com rendimentos de 800 U/g de massa celular.

O desenvolvimento do bioprocesso de produção de asparaginase, empregando-se diferentes estratégias de condução do bioprocesso, em frascos agitados e em biorreator instrumentado, resultou também em um aumento bastante significativo em termos de rendimento e de produtividade volumétricos. Em cultivos com elevadas densidades celulares conduzidos em biorreator de 2 L foram obtidos 107 g de célula (em peso seco)/L de meio de cultura, 85600 U/L e 1083 U/L.h.

LADEBIO - Laboratório de Desenvolvimento de Bioprocessos da Escola de Química da UFRJ